研究背景
在過去十年間，發光納米晶體作為多功能診療納米前藥（NPDs），在早期癌癥診斷和治療方面發展迅速。鑭系摻雜的發光納米晶體因具有獨特的上轉換（UC）/ 近紅外二區（NIR-II）熒光特性，以及可作為治療成分的放射性鑭系摻雜劑，在實際臨床應用中展現出巨大潛力。當這些納米前藥表面功能化有腫瘤靶向配體時，能靶向腫瘤細胞的不同部位，提升治療效果。然而，開發能夠直接將診斷和治療有效載荷輸送到腫瘤細胞核的腫瘤細胞核靶向鑭系診療納米前藥，仍然是一項極具挑戰性的任務。
研究內容
（一）納米前藥的設計與制備
研究團隊提出了一種新穎的設計策略，制備了用放射性镥 - 177（177Lu）標記的腫瘤細胞核靶向鑭系診療納米前藥（177Lu-YNP@FA NPDs）。他們將鑭系發光對 Yb/Er 和鑭系放射性核素177Lu分別摻入NaYF4@NaYF4核殼納米晶體的核層和殼層，使納米前藥能發出明亮的可見 UC 和 NIR - II 熒光，以及自發發射高能 β 射線輻射。同時，納米晶體表面用 DSPE - PEG - FA 進行功能化修飾，DSPE - PEG - FA 作為腫瘤細胞核靶向配體，能特異性識別過表達葉酸受體 α（FR - α）的腫瘤細胞，如宮頸癌細胞系 Hela 細胞。
方案1：腫瘤細胞核靶向設計策略示意圖177Lu-YNP@FA同時上轉換/NIR-II擴散發光的NPD以及放射性β射線輻射在高效腫瘤擴散定位和放射性核素治療中的作用。
通過兩步外延生長法，再經疏水范德華相互作用進行表面功能化，成功構建了177Lu-YNP@FA納米前藥。透射電鏡（TEM）和高分辨率透射電鏡（HRTEM）圖像顯示，該納米前藥呈均勻球形，單分散性良好且為單晶結構。動態光散射（DLS）分析表明，其在生理鹽水（NS）和胎牛血清（FBS）中的平均流體動力學尺寸分別約為 79nm 和 24nm，且在溶液中具有良好的長期穩定性。
（二）納米前藥的性能研究
1. 熒光性能：177Lu- YNP@FA 納米前藥在 980nm 二極管激光激發下，能在可見（~532 和～650nm）和 NIR - II（~1532nm）光譜區域同時發出明亮的 UC 和 NIR - II 熒光，且其光致發光（PL）穩定性明顯優于美FDA批準的吲哚菁綠（ICG）染料。
圖1（a）腫瘤細胞核靶向制備過程示意圖177Lu-YNP@FANPD。（b、c）代表性TEM和高分辨率TEM圖像177Lu-YNP@FA水中的NPD。（d）隨時間變化的平均水動力尺寸177Lu-YNP@FANS和FBS溶液中的NPD，顯示其流體動力學尺寸隨時間幾乎不變，表明其具有長期的水穩定性。（e）177Lu放射性核素的放射性標記率和放射化學速率177Lu-YNP@FANPD。（f）放射性化學穩定性177Lu-YNP@FANPDs在NS、FBS和全血溶液中分散不同時間后。（g） Er3+的典型UC（左）和NIR-II熒光（右）光譜及其相應的PL圖 177Lu-YNP@FA（h）簡單的能級圖，描繪了Yb3+和Er3+離子之間的能量轉移過程，該過程負責在980nm二極管激光激發下產生明亮的UC和Er3+的NIR-II熒光。（i） 光穩定性比較177Lu-YNP@FANPD和FDA批準的ICG染料分別在連續980 nm二極管激光照射（~100 mW cm-2）和650 nm氙燈（~5 mW cm-2）下照射120min
2. 靶向能力：利用定制的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）系統，以Er3+的可見 UC 熒光為熒光指示劑，研究發現 Hela 細胞與177Lu- YNP@FA 納米前藥孵育 8h后，細胞核內呈現強烈的綠色 UC 熒光，而正常人類永生化角質形成細胞（HaCaT）幾乎檢測不到 UC 熒光信號。在共培養實驗中，納米前藥也主要定位于 Hela 細胞的細胞核。這表明177Lu- YNP@FA 納米前藥對宮頸癌細胞核具有特異性靶向能力。此外，該納米前藥能在 4h內進入 Hela 細胞并到達細胞核，通過配體（DSPE - PEG - FA）與受體（FR - α）的相互作用，在 8h內快速靶向 Hela 細胞核。
圖2（a）配備980nm激發光源的定制CLSM系統中腫瘤細胞靶向UC成像的示意圖。（b）Hela、（c）HaCaT和（d）與Hela-mCherry和HaCaT細胞共培養后的代表性UC CLSM圖像177Lu-YNP@FA（80μg/mL，10μL）NPD處理8h（λexc=980 nm，λem=532 nm）。（e） Hela細胞在孵育后的UC CLSM圖像比較177Lu-YNP@FANPDs具有不同的流體動力學尺寸，跨度為~43-93nm，持續4h。（f）用Alexa Fluor?488染色的Hela細胞的免疫熒光圖像（λexc=495nm，λem=519nm），表明FR-α在Hela細胞細胞質和細胞核中都過表達。（g） 與Hela細胞一起孵育的原位時間依賴性UC CLSM圖像177Lu-YNP@FA濃度為80μg/mL的NPDs。（h）用以下物質孵育的Hela細胞的代表性生物TEM圖像177Lu-YNP@FA在指定時間點的NPDs（80μg/mL，10μL），其中細胞對177Lu-YNP@FANPD用白色箭頭標記。
3. 體內腫瘤靶向與治療效果：在體內實驗中，利用 BALB/c 裸鼠腹腔轉移性宮頸癌模型，通過 NIR - II 熒光成像發現，177Lu- YNP@FA納米前藥能精準定位小鼠腹腔內的轉移性宮頸癌腫瘤，且離散的熒光信號與 ICG 處理的對照組明顯不同。經 NIR - II 熒光成像引導手術切除的組織，經蘇木精 - 伊紅（H&E）染色證實為轉移性宮頸癌腫瘤，這證明了該納米前藥在活體小動物中具有出色的特異性腫瘤靶向能力。
圖3（a） BALB/c裸鼠腹腔轉移性宮頸癌的體內腫瘤定位和手術切除示意圖177Lu-YNP@FA基于NIR-II熒光成像的NPD。（b） 體內分布177Lu-YNP@FA腹腔注射0-24h后，使用我們自制的NIR-II熒光顯微鏡成像系統觀察攜帶轉移性宮頸癌的BALB/c裸鼠腹腔中的NPD。（g-h）ICG處理的對照BALB/c裸小鼠的體內近紅外熒光成像，顯示臨床使用的ICG染料缺乏腫瘤靶向能力。（b、c、d、g、h都由睿光科技的NirVivo-Pro小動物活體成像系統拍攝）
在抗癌效果方面，體外實驗表明，與游離的177LuCl3和 YNP@FA 對照組相比，177Lu- YNP@FA 納米前藥對 Hela 細胞具有顯著更高的抑制能力，且呈輻射劑量依賴性。在超低輻射劑量下，就能殺死大量 Hela 細胞。進一步研究發現，其增強的抗癌效果主要歸因于細胞焦亡，而非細胞凋亡。
體內實驗以 BALB/c 裸鼠皮下宮頸癌腫瘤模型進行，177Lu- YNP@FA 納米前藥在腫瘤中的生物半衰期約為 7.1 天，具有優異的腫瘤積累和保留能力，能有效抑制宮頸癌腫瘤生長，且在治療過程中對小鼠體重影響較小，無明顯副作用。治療后對腫瘤組織的組織病理學分析也證實了其良好的抗腫瘤效果。
圖4（a） 用游離177LuCl3孵育后Hela細胞的細胞活力，YNP@FA以及177Lu-YNP@FA當在水中分散48h時，不同劑量的NPDs。（b）游離177LuCl3和177Lu-YNP@FA通過放射測量法測定Hela細胞的NPDs。（c）細胞集落形成，（d）球體形成能力，以及Hela細胞在用生理鹽水（NS）、游離177LuCl3（~6μCi）處理后的（e）細胞周期分布和（f，g）細胞凋亡的流式細胞術研究，YNP@FA，以及177Lu-YNP@FA用NS、游離177LuCl3（~6μCi）處理后，一些隨機選擇的Hela細胞的代表性（h，i）SEM和（j，k）生物TEM圖像，YNP@FA，以及177Lu-YNP@FA（~6μCi）NPD持續24h。
4. 生物相容性：對接受不同處理的皮下宮頸癌荷瘤 BALB/c 裸鼠進行血液學和組織學檢測，結果顯示，177Lu- YNP@FA 納米前藥治療后，小鼠血液中與腫瘤相關的炎癥細胞水平顯著降低，血液中乳酸脫氫酶（LDH）含量也明顯低于對照組，且其他生化指標無顯著變化。主要器官的 H&E 染色圖像顯示，該納米前藥對正常組織無明顯病理炎癥或損傷，表明其具有良好的生物相容性和生物an全性。
圖5（a） 皮下宮頸癌單次瘤內注射治療方案示意圖。（b） 攜帶皮下宮頸癌的BALB/c裸鼠在瘤內注射游離177LuCl3和177Lu-YNP@FANPDs的劑量約為100μCi。（c） 游離177LuCl3和177Lu-YNP@FA用γ計數器測量不同時間攜帶BALB/c裸鼠皮下宮頸癌的NPDs。（d） 攜帶皮下宮頸癌的BALB/c裸小鼠在接受單次瘤內注射游離177LuCl3和177Lu-YNP@FANPDs的劑量約為100μCi。（e） 游離177LuCl3（~100μCi）生理鹽水的腫瘤生長曲線，YNP@FA，以及177Lu-YNP@FA（~100μCi）治療攜帶宮頸癌的BALB/c裸鼠（n=6）。通過Student t檢驗計算統計顯著性。無統計學意義：p>0.05，**p<0.01。（f） （e）中治療后21天每組解剖腫瘤組織的數碼照片。（g） 不同處理42天后，攜帶皮下宮頸癌的BALB/c裸鼠的存活率和（h）體重情況（n=6）。（i） 分別用H&E、TUNEL和Ki-67抗原對每組解剖的腫瘤組織進行病理分析。
研究意義
這項研究開發出了腫瘤細胞核靶向的鑭系診療納米前藥，為精確的腫瘤熒光定位和有效的放射性核素治療提供了新方法。177Lu- YNP@FA 納米前藥能快速靶向 Hela 細胞核，實現對微小轉移性宮頸癌腫瘤的精準定位和切除，且在體內外均展現出優異的抗腫瘤效果。其抗腫瘤效果主要源于細胞焦亡，而非細胞凋亡。這些研究結果為開發多種基于鑭系的診療納米前藥奠定了基礎，有望在未來實現an全有效的癌癥放射治療。
